1940年秋冬至1941年春，国民党顽固派掀起了第二次反共高潮，制造了震惊中外的“皖南事变”，中国共产党领导的皖南新四军损失惨重，国共合作一度面临破裂，抗日民族统一战线岌岌可危。成功打退这次反共高潮是中国共产党对国民党斗争的一次重大胜利，为抗日战争相持阶段中共自身的生存与发展带来了转机，也对中国抗战的政局和战局产生了深远影响。
抗日战争进入相持阶段后，国民党对八路军、新四军实力不断壮大极为不安，先后制造了一系列的军事摩擦，试图运用军事手段遏制中共武装力量的发展。在国民党看来，八路军、新四军分布在华中地区的军事力量已对其造成严重威胁，必须尽快将此区域的中共势力分散至其他地区，以保证国民党势力在华中地区的绝对控制。
1940年10月19日，国民政府军事委员会以参谋总长何应钦、副参谋总长白崇禧的名义向朱德、彭德怀、叶挺发出“皓电”，成为第二次反共高潮的起点。“皓电”大肆污蔑八路军、新四军，捏造多项罪名：一、不守战区范围自由行动；二、不遵守编制数量自由扩充；三、不服从中央命令破坏行政系统；四、不打敌人专事吞并友军。来电并下令要求长江以南地区的八路军、新四军在一个月之内离开当前控制区，向北开到黄河以北，将八路军、新四军50万人合并缩编为10万人。
如果八路军、新四军遵照军令北移，就会失去长江以南地区的根据地；如果拒不遵行，将承担“破坏团结抗战”的责任，在政治上陷于被动。“皓电”引起社会各界的广泛关注，中间势力虽然普遍同情中共，但更关心国共团结问题，均力主劝说中共以妥协让步维护国共合作。
面对“皓电”的调遣命令、国民党新一轮的反共舆论以及中间势力对中共“以妥协挽救局势”的期待，中共决定争取舆论主动权，“对皖南取让步政策，对华中取自卫政策”。11月9日，中共中央以朱德、彭德怀、叶挺、项英名义复电何应钦、白崇禧（即“佳电”），驳斥“皓电”的反共污蔑，揭露其“以内战代抗战，以投降代独立，以分裂代团结，以黑暗代光明”的险恶用心，严词拒绝国民党强迫八路军和新四军全部撤到黄河以北的无理要求，同时表示，为顾全大局，坚持团结抗战，新四军驻皖南部队将开赴长江以北。“佳电”的发表，在社会上取得很好的反响。
随后，中共中央指示新四军军长叶挺、副军长项英等人要做好撤出长江以南地区的准备，要求“必须12月底全部开动完毕”，以皖南的让步换得对中间派的政治影响，借此争取中间党派和进步势力的支持。
1940年12月，叶挺安排皖南新四军部队教导总队教职员、军医处医护人员等后勤人员约1700人组成先遣支队，经国民党指定路线北移，先遣人员一行畅通无阻，顺利抵达苏北地区。
1941年1月4日，新四军《抗敌报》发表社论《临别之言》和由军长叶挺、副军长项英、政治部主任袁国平、副参谋长周子昆署名的《新四军为离开皖南进军敌后告皖南同胞书》。当天晚上，新四军军部及所属皖南部队9000余人在叶挺、项英率领下，唱着歌曲《别了，皖南》，由安徽泾县云岭启程，踏上了北移的征程。“前进号响，大家准备好。子弹上膛，刺刀出鞘。三年的皖南，别了。目标，扬子江头，淮河新道。哪个来拦路，哪个被打倒。冲过重重叠叠的封锁，冲进日本鬼子的窝巢。我们一定胜利。我们一定达到目标。”这首飘荡在雨夜林间、由政治部主任袁国平作词的歌曲，既唱出了新四军对皖南一草一木的惜别之情，也唱出了他们一往无前，与日寇血战到底的决心。
与此同时，国民党加紧完成了对皖南新四军的包围。早在1940年12月10日，蒋介石就正式批准国民政府军令部关于实施《剿灭黄河以南匪军作战计划》的要求和《解决江南新四军方案》，并电告第三战区长官顾祝同：新四军部队不准东去苏南转苏北，只准由江南原地北渡皖东；该部于31日最后期限之日“仍不遵命北渡，应立即将其解决，勿再宽容”。顾祝同即于12月10日和26日密令所部向皖南新四军集结包围，构筑碉堡，做好“彻底肃清”“匪巢”的准备。
1941年1月6日，新四军途经泾县茂林地区时，突然遭到预伏的国民党军队袭击，双方展开激战，寂静的山间顿时弹炮如雨，血流成河。7日至9日，新四军一度击退国民党军队，然而因缺乏粮食等补给，10日以后新四军全军陷入困境，至14日晚，新四军被围困部队在国民党军队7个师约8万人的猛烈攻势之下，仅2000余人先后突围，其余均被俘或牺牲。这里有坚持南方三年游击战争的红军骨干，有延安派来的经过长征的领导干部，有中共南方各级党组织选派到新四军的优秀党员，有投笔从戎请缨抗战的知识分子，有毁家纾难的爱国侨胞，还有杀敌不让须眉的巾帼英豪。其中，军长叶挺与国民党军队谈判时被扣押，副军长项英、参谋长周子昆被叛徒杀害，政治部主任袁国平在突围中壮烈牺牲。
1月17日，国民党反诬新四军“叛变”，取消新四军番号，声称将军长叶挺交付“军法审判”。这就是抗战史上令亲者痛、仇者快的皖南事变，是国民党顽固派发动的第二次反共高潮的最高峰。
皖南事变发生后，国共双方矛盾达到了顶点，国共合作距离分裂咫尺之遥。为了抗日大局，中共中央同国民党顽固派展开了针锋相对的斗争，在政治上对国民党全面反攻，将国民党破坏团结、破坏抗日民族统一战线的丑恶行径公之于众，围绕皖南事变，运用一切途径，广泛传播真相，争取最广泛的国内外同情与支持。
中共中央南方局书记周恩来，在重庆同国民党进行谈判斗争，并在宣传战线上进行了猛烈攻击。为揭露皖南事变真相，1月18日的《新华日报》刊登周恩来书写的“为江南死国难者志哀”的题词和“千古奇冤，江南一叶；同室操戈，相煎何急”的诗句。
中共中央还针对国民政府混淆视听的舆论宣传予以有力驳斥。 皖南事变发生后，国民党为争取中间势力，将皖南事变定性为“纯粹军纪问题”，强调事变“绝不含政治的、或党派斗争的意义”，将责任归咎于新四军“不遵守命令，攻击友军”。 对此歪曲事实的宣传论调，中共中央坚决予以驳斥，指出皖南事变绝非所谓“军纪问题”，而完全“是政治问题，是全局问题，是与外交分不开的问题”。
1941年1月20日，中共中央革命军事委员会为茂林巨变（皖南事变）发表重要命令与讲话。中国第二历史档案馆藏
1月20日，中共中央军委发布命令，重建新四军军部，由陈毅任代军长，刘少奇任政治部委员。 1月25日，新四军新军部在苏北盐城成立，此举是对蒋介石反共行径的最有力回击，不仅直接宣告蒋介石的取缔命令无效，还意味着重建后的新四军，将放手在华中地区开展抗日斗争，不再受国民党的掣肘。
中共中央应对皖南事变与蒋介石第二次反共高潮的举措取得了显著效果，国民党受到了各方的指责。国际方面，苏、美、英三国都对国民党表示了不满。广大华侨在得知皖南事变的真相后，纷纷谴责国民党。陈嘉庚批评皖南事变是“自为鹬蚌，势必利落渔人”。国内方面，中间派纷纷对国民党的分裂行径提出批评。黄炎培表示：“当局如此处置绝对错误。”参政员张一麟等人联名致电国民政府，要求制止内战，反对枪口对内。章伯钧等则准备发起成立民主联合运动，要求与中共积极联合，以抵抗国民党的压迫。国民党内部对于皖南事变的态度也出现了分歧。冯玉祥指责这是一个“阴谋”，孙科表示“忧虑”，宋庆龄与柳亚子、何香凝、彭泽民等则于1月12日发表宣言，称“倘不幸而构成剿共之事实，岂仅过去所历惨痛又将重演，实足使抗建已成之基础隳于一旦”。
同时，中共方面则获得了国内外广泛的同情和支持，国内外各民众团体、海外华人华侨团体、国内外各媒体、国民党左派人士等纷纷赞扬新四军及八路军的抗战功绩，要求国民党停止打击共产党、恢复新四军、释放皖南事变中被俘人员及军长叶挺等。
国民党当局在政治上陷于空前孤立的形势下，不得不收敛其反共活动。3月6日，蒋介石在第二届国民参政会上作出公开声明：“以后再亦决无剿共的军事。”
国民党顽固派制造皖南事变，并没有达到打击共产党、消灭新四军的目的，反而惊醒和教育了对国民党抱有幻想的人们，再次证明了中国共产党维护抗战大局的态度，扩大了中国共产党在群众中的影响，提高了中国共产党在全国的政治地位。
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